紫外可見(jiàn)分光光度法

    紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800nm波長(cháng)范圍內測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當光穿過(guò)被測物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長(cháng)不同而變化。因此，通過(guò)測定物質(zhì)在不同波長(cháng)處的吸光度，并繪制其吸光度與波長(cháng)的關(guān)系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定大吸收波長(cháng)λmax和小吸收波長(cháng)λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結構相關(guān)的特征性。因此，可以通過(guò)特定波長(cháng)范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較，或通過(guò)確定大吸收波長(cháng)，或通過(guò)測量?jì)蓚€(gè)特定波長(cháng)處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時(shí)，在大吸收波長(cháng)處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數法求算出樣品溶液的濃度。

    儀器的校正和檢定

    1.波長(cháng) 由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長(cháng)經(jīng)常會(huì )略有變動(dòng)，因此除應定期對所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長(cháng)。常用汞燈中的較強譜線(xiàn)237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.lOnm譜線(xiàn)進(jìn)行校正；鈥玻璃在波長(cháng)279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長(cháng)校正用，但因來(lái)源不同或隨著(zhù)時(shí)間的推移會(huì )有微小的變化，使用時(shí)應注意；近年來(lái)，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho2O3）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長(cháng)為241.13nm，278.lOnm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

    儀器波長(cháng)的允許誤差為：紫外光區±1nm，500nm附近±2nm。

    2.吸光度的準確度 可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱(chēng)定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋1000ml，在規定的波長(cháng)處測定并計算其吸收系數，并與規定的吸收系數比較，應符合表中的規定。

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      波長(cháng)/nm                  235（?。?    257（大）     313（?。?     350（大）

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    吸收系數（）的規定值          124.5          144.0          48.6           106.6                                         

    吸收系數（）的許可范圍    123.0～126.0   142.8～146.2   47.0～50.3     105.5～108.5

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    3.雜散光的檢查 可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規定的波長(cháng)處測定透光率，應符合表中的規定。

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     試劑   濃度/%（g/ml）  測定用波長(cháng)/nm   透光率/%

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    碘鈉      1.00           220          <0.8

    亞硝酸鈉    5.00           340          <0.8

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    對溶劑的要求

    含有雜原子的有機溶劑，通常均具有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(cháng)。例如甲醇、乙醇的截止使用波長(cháng)為205nm。另外，當溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(cháng)附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內不得超過(guò)0.20，在251～300nm范圍內不得超過(guò)0.10，在300nm以上時(shí)不得超過(guò)0.05。

    測定法

    測定時(shí)，除另有規定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規定的吸收峰波長(cháng)±2nm以?xún)葴y試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規定波長(cháng)附近自動(dòng)掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長(cháng)位置是否正確。除另有規定外，吸收峰波長(cháng)應在該品種項下規定的波長(cháng)±2nm以?xún)?，并以吸光度大的波長(cháng)作為測定波長(cháng)。一般供試品溶液的吸光度讀數，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的十分之一，否則測得的吸光度會(huì )偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增大為準。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數后再計算含量。

    當溶液的pH值對測定結果有影響時(shí)，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。

    1.鑒別和檢查 分別按各品種項下規定的方法進(jìn)行。

    2.含量測定 一般有以下幾種方法。

    （1）對照品比較法 按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的100%±10%，所用溶劑也應*一致，在規定的波長(cháng)處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：

    cx=（Ax/AR）cR

    式中 cx為供試品溶液的濃度；

         Ax為供試品溶液的吸光度；

         cR為對照品溶液的濃度；

         AR為對照品溶液的吸光度。

    （2）吸收系數法 按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規定的波長(cháng)處測定其吸光度，再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時(shí)，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。

    （3）計算分光光度法 計算分光光度法有多種，使用時(shí)應按各品種項下規定的方法進(jìn)行。當吸光度處在吸收曲線(xiàn)的陡然上升或下降的部位測定時(shí)，波長(cháng)的微小變化可能對測定結果造成顯著(zhù)影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

    （4）比色法 供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區沒(méi)有強吸收，或在紫外光區雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當的顯色劑，使反應產(chǎn)物的大吸收移可見(jiàn)光區，這種測定方法稱(chēng)為比色法。

    用比色法測定時(shí)，由于顯色時(shí)影響顯色深淺的因素較多，應取供試品與對照品或標準品同時(shí)操作。除另有規定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理。在規定的波長(cháng)處測定對照品和供試品溶液的吸光度后，按上述（1）法計算供試品濃度。

    當吸光度和濃度關(guān)系不呈良好線(xiàn)性時(shí)，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充同一體積，顯色后測定各份溶液的吸光度，然后以吸光度與相應的濃度繪制標準曲線(xiàn)，再根據供試品的吸光度在標準曲線(xiàn)上查得其相應的濃度，并求出其含量。