生化培養箱中的大腸桿菌的檢測方法

大腸菌群測定的操作細則大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)食品的衛生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。

　　食品中大腸菌群數系以100mL（g）檢樣內大腸菌群可能數（MPN）表示。

　　1 設備和材料1.1 生化培養箱：恒定溫度36±1℃。

　　1.2 冰箱：0～4℃。

　　1.3 恒溫水浴 :44.5±0.5℃。

　　1.4 天平。

　　1.5 顯微鏡。

　　1.6 均質(zhì)器或乳缽。

　　1.7 平皿：直徑為90mm。

　　1.8 試管。

　　1.9 吸管。

　　1.10 廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL。

　　1.11 玻璃珠：直徑約5mm。

　　1.12 載玻片。

　　1.13 酒精燈。

　　1.14 試管架。

　　2 培養基和試劑2.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管：按GB 4789.28中4.9規定。

　　2.2 伊紅美藍瓊脂平板：按GB 4789.28中4.25規定。

　　2.3 乳糖發(fā)酵管：按GB 4789.28中4.10規定。

　　2.4 EC 肉湯：按GB 4789.28中4.11規定。

　　2.5 磷酸鹽緩沖稀釋液：按GB 4789.28中3.22規定。

　　2.6 生理鹽水。

　　2.7 革蘭氏染色液：按GB 4789.28中2.2規定。

　　3 操作步驟3.1 檢樣稀釋3.1.1 以無(wú)菌操作將檢樣25mL（或g）放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jì)龋ㄆ績(jì)扔柚眠m當數量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣用均質(zhì)器，以8 000-10 000 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。

　　3.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。

　　3.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。

　　3.1.4 根據食品衛生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種3管。

　　3.2 乳糖發(fā)酵試驗將待檢樣品接種于乳糖 膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃ 溫箱內，培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

　　3.3 分離培養將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃ 溫箱內，培養18-24h,然后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗。

　　3.4 證實(shí)試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置 36±1℃溫箱內培養24±2h,觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。

　　3.5 報告根據證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。

　　4 糞大腸菌群（faecal coliform）4.1 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養物（見(jiàn)3.2條）轉種于EC肉湯管內，置44.5±0.2℃水浴箱內（水浴箱內的水面應高于EC肉湯液面），培養24±2h,經(jīng)培養后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，置 培養18-24h,凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。

　　4.2 結果報告根據證實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數，查MPN檢索表，報告每100mL（g）糞大腸菌群的MPN值。