培養細胞需注意哪些小細節?

　　培養細胞就像養育孩子一樣，要精心照料，用心呵護。每天都去看看它們，滿(mǎn)足它們所需要的物質(zhì)需求，防止出現培養箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細節，以免開(kāi)展重復的實(shí)驗導致不必要的人力物力浪費。

　　那培養細胞都要注意哪些小細節呢?就讓我們一起來(lái)看看吧!

　　1.細胞生長(cháng)的營(yíng)養來(lái)源

　　不同的細胞的培養基是不相同的，對于大多數腫瘤細胞來(lái)說(shuō)，營(yíng)養配方一般為：90%合成培養基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染，可以適時(shí)加1%雙抗，抗生素的使用應為短期。

　　Q：細胞培養基配方如何選擇?

　　A:
一般購買(mǎi)細胞時(shí)，針對不同的細胞株，會(huì )有詳細的介紹，包括生長(cháng)的狀態(tài)圖、培養基的類(lèi)型等。如人源肺癌細胞A549可用DMEM培養基，在胎牛血清的選擇上也可以選用來(lái)源可靠的胎牛血清，能提供較好的營(yíng)養成分，以滿(mǎn)足細胞株生長(cháng)的需要。

　　Q：如果細胞生長(cháng)緩慢，需要增加血清比例嗎?

　　A：可以。

　　2.細胞生長(cháng)的環(huán)境

　　舒適無(wú)菌的環(huán)境是細胞健康生活的重要基礎。需要合適的器皿，不同形狀、規格、用途多樣的培養皿、培養瓶及培養板等，最終進(jìn)入合適的恒溫箱培養，如腫瘤細胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長(cháng)。

　　Q：細胞培養板及培養皿或培養瓶如何選擇?

　　A：根據不同的應用選擇不同的培養皿或容量板，如MTS用96孔板，細胞爬片用24孔，流式分析用6空等

　　而選擇培養皿還是選擇培養瓶，就細胞培養狀態(tài)來(lái)說(shuō)差別不大，主要是培養瓶的安全系數更高一些，數量也會(huì )大一些，但是成本也相對較高，因此沒(méi)有特殊要求時(shí)，一般用培養皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無(wú)菌?

　　A：這取決于您的應用。

　　滅活過(guò)程中，會(huì )導致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長(cháng)因子等。所以只有在您的實(shí)驗對血清有特殊要求時(shí)，才會(huì )考慮對血清進(jìn)行滅活處理。如您的實(shí)驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見(jiàn)的情況是需要去除血清中的補體蛋白，因為補體在機體中參與細胞殺傷，巨噬細胞和淋巴細胞活化，肥大細胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過(guò)程，所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細胞和干細胞的培養過(guò)程中需要對血清進(jìn)行滅活處理。

　　3.細胞復蘇與凍存

　　細胞復蘇是指將凍存的細胞解凍之后再重新培養，細胞從冷凍停止生長(cháng)狀態(tài)恢復生長(cháng)的過(guò)程。

　　Q：細胞復蘇后，為什么很多難以貼壁?

　　A：忽略培養基的問(wèn)題，主要考慮細胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復蘇時(shí)動(dòng)作太慢導致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管，使之盡快通過(guò)最易受損的溫度段(-5～0℃)。

　　細胞凍存則是將細胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境，降低細胞內的代謝活動(dòng)，最/大限度的保存細胞活力，以便長(cháng)期存儲。

　　Q：目前細胞凍存液多采用的什么配方?

　　A：目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細胞的傳代培養

　　細胞在培養過(guò)程中不斷增殖，培養皿空間有限，細胞過(guò)密生長(cháng)就會(huì )受到抑制，影響細胞的狀態(tài)，因此我們要把細胞中的一部分分到別的培養皿里，這樣細胞才能生長(cháng)的好。

　　Q：細胞傳代培養為什么要選擇對數期細胞?

　　A:
細胞的生長(cháng)和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數期(指數期)，平穩期(平臺期)和衰退期。為了確?；盍?，遺傳穩定性和表型穩定，必須使細胞保持在對數期。一般細胞長(cháng)到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個(gè)環(huán)節的關(guān)節問(wèn)題外，細胞培養還有很多小問(wèn)題如下：

　　Q：培養基多久換一次?

　　A:
正常情況下，培養液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養基變黃，說(shuō)明培養液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細胞會(huì )脫落死亡，需要更換新鮮培養液。一般細胞生長(cháng)旺盛時(shí)1～2天換一次，生長(cháng)緩慢時(shí)，3～4天亦可。針對復蘇后的細胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應如何融解?

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過(guò)程中不時(shí)旋轉(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養基，用新的培養基或者PBS洗滌2-3次，再開(kāi)始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來(lái)的細胞懸液加入到新的培養瓶?jì)?。后續再密切觀(guān)察。

　　Q：血清中出現絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

　　A：多種原因可能導致絮狀沉淀的形成，最常見(jiàn)的原因之一是融化過(guò)程中，脂蛋白聚集所致。該現象一般不會(huì )影響產(chǎn)品質(zhì)量?？梢?00g離心5分鐘，取上清，然后過(guò)濾。根據需要選擇合適的濾膜孔徑，一般常用的是0.22um
PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養基內一起過(guò)濾而不是直接過(guò)濾血清。

　　總之，細胞培養是后續實(shí)驗的基石，留心各種細節問(wèn)題，嚴守滅菌處理的程序，保護好自己養的細胞，這樣才能快樂(lè )地進(jìn)行后續的實(shí)驗。